Pesquisadores desenvolvem nova técnica de facão para cortar o genoma do câncer e estudar alterações no número de cópias

MACHETE permite a engenharia eficiente de deleções genômicas. a, Esquema da abordagem MACHETE. WT, tipo selvagem; HA, braço de homologia; Puro, puromicina; pA, sinal de poliadenilação. b, Esquema de engenharia mediada por MACHETE de uma deleção de 4,1 Mb no locus 11B3. c, coloração violeta de cristal de WT, células 11B3 KI e Δ11B3 NIH3T3 após seleção com Puro a 2 μg ml⁻¹ e/ou DT-A a 50 ng ml⁻¹. d, genotipagem de PCR para os alelos 11B3 KI e Δ11B3 nas linhas celulares NIH3T3 indicadas. e, Esboço experimental para testar o impacto da seleção negativa mediada por DT na eficiência da engenharia de deleção de Δ11B3 em células NIH3T3 (esquerda). Análise clonal de células NIH3T3 manipuladas sem (−DT) e com (+DT) seleção de DT (direita). f, sequenciação Sanger do ponto de interrupção de deleção de 11B3 confirmando a deleção esperada. g, Esquema de engenharia mediada por MACHETE de uma deleção de 45 Mb no locus 7q11-22 em células HEK293. gcv, ganciclovir. h, gráficos de citometria de fluxo e quantificação de BFP⁺ e BFP⁻células HEK293 nas condições indicadas. i, genotipagem de PCR para os alelos 7q11 KI e Δ7q11-22 em células HEK293 sob as condições indicadas.+. Crédito: Natureza Câncer (2022). DOI: 10.1038/s43018-022-00443-5

As pessoas já estão chamando isso de Papel Machete.

Ainda assim, os principais autores Francisco “Pancho” Barriga e Kaloyan Tsanov, do Sloan Kettering Institute, não querem que o nome de sua nova técnica de pesquisa ofusque suas descobertas, que lançam uma nova luz sobre um mudança genética que contribui para cerca de 15% de todos os cânceres e que pode ajudar a identificar pacientes com probabilidade de responder a imunoterapias.

MACHETE é o que a dupla chama de método baseado em CRISPR que eles desenvolveram para estudar as alterações no número de cópias, ou CNAs, que são alterações genéticas em larga escala que ocorrem frequentemente no câncer.

A sigla MACHETE significa Alteração Molecular de Cromossomos com Elementos Tandem de Engenharia. É uma nova maneira de fatiar seções específicas do código genético para espelhar as mudanças que surgem no câncer e em outras doenças humanas.

Isso significa que, pela primeira vez, há uma maneira direta e eficiente de estudar as deleções de CNA em modelos de laboratório – como os modelos de camundongos de câncer de pâncreas e melanoma usados ​​em seu estudo, publicado em Natureza Câncer em 7 de novembro de 2022.

“No começo, nem queríamos colocar MACHETE no título de nosso artigo, para destacar melhor a fascinante biologia que encontramos”, diz Dr. Barriga, pós-doutorando do Instituto, que é o braço de pesquisa experimental do o Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK).

Ainda assim, isso não impediu um colega de laboratório de colar uma foto do famoso personagem de Danny Trejo, Machete, em sua mesa depois que ele apresentou o trabalho pela primeira vez. Nem outro cientista twittou uma cópia da pré-impressão do artigo no Twitter do ator. (O gesto não foi correspondido, infelizmente.)

Além das mutações de câncer de gene único

Para entender as maneiras pelas quais o estudo abriu novos caminhos em relação a uma das alterações mais comuns no número de cópias em cânceres humanos – e o que isso pode significar para os pacientes no futuro – é preciso avaliar a biologia subjacente.

Muitas pessoas pensam nas mutações no câncer como pequenos “erros de digitação” no código genético que afetam a atividade de um único gene – seja ligando-o ou desligando-o. E por décadas, os pesquisadores também se concentraram principalmente nesses pequenos erros que causam muitos tipos de câncer.

As alterações no número de cópias, no entanto, podem afetar dezenas de genes simultaneamente e duplicar ou excluir grandes seções de cromossomos individuais.

Um tumor típico carrega uma média de 24 CNAs diferentes que afetam até 30% de seu genoma, observam os pesquisadores.

“As mutações pontuais são relativamente mais fáceis de estudar do que os CNAs”, diz o Dr. Tsanov, que, como Barriga, é um pós-doutorando no laboratório do investigador Scott Lowe, autor sênior do estudo e presidente do Programa de Biologia e Genética do Câncer do Instituto. “Mas os CNAs são igualmente importantes – eles são muito mais complexos.”

Tumores com um nível mais alto de CNAs – também conhecidos como carga de CNA – estão ligados à recorrência e piores resultados em câncer de mama, próstata, endométrio, células claras renais, tireóide e colorretal, segundo pesquisas anteriores do MSK.

Mas, novamente, o tamanho e a variedade das mudanças – afetando milhares, ou mesmo milhões, de pares de bases de DNA em vez de apenas a alteração de uma única letra na sequência de DNA – tornou muito difícil recriá-las em modelos de laboratório. para estudo próximo.

Uma nova abordagem potencial para estudar exclusões em grande escala chegou ao Dr. Barriga enquanto ele voltava para casa do laboratório no bonde da Ilha Roosevelt.

“Perguntei-me: ‘Como podemos selecionar células com as exclusões pretendidas, mesmo que sejam muito raras?’ ” ele diz. “Eu tive uma ideia e elaborei o conceito inicial para o que seria a estratégia geral naquela noite. Quando tentamos, simplesmente funcionou. Talvez eu nunca tenha conseguido algo tão bem pelo resto da minha carreira.”

Descobrir a combinação certa de palavras para fazer a sigla MACHETE funcionar levou mais tempo, brinca. Mas a dupla sabia que estava no caminho certo quando mudanças genéticas feitas com MACHETE em um modelo de rato de adenocarcinoma ductal pancreático resultaram nos mesmos resultados de uma mutação natural semelhante em um modelo de rato diferente que Dr. Tsanov estava estudando para um projeto separado.

“Foi realmente uma estreita colaboração a partir daí”, diz o Dr. Tsanov. A equipe de pesquisa também incluiu mais de uma dúzia de outros cientistas do MSK, do Ontario Institute for Cancer Research, da New York University Grossman School of Medicine e do Princess Margaret Cancer Center, em Toronto.

A pesquisa pode ajudar a identificar quais pacientes se beneficiarão da imunoterapia

Depois que as células geneticamente “machetadas” foram inseridas no pâncreas de camundongos de laboratório, os camundongos desenvolveram câncer. As alterações genéticas removeram uma fatia do cromossomo 9 e, com ela, um gene conhecido como CDKN2A – um gene supressor de tumor bem estabelecido. Como esperado, isso desligou a capacidade inata das células de impedir o surgimento de células tumorais.

Essa fatia ampla também removeu o código genético de um grupo de interferons – proteínas que acionam as células imunológicas para combater invasores, como células cancerígenas – cuja importância os cientistas queriam testar.

Um dos CNAs mais prevalentes em pessoas afeta essa região cromossômica – 9p21.3 – e cerca de metade dos pacientes com ela desenvolvem tumores nos quais esses interferons também estão ausentes.

“Nós sabemos sobre as mutações CDKN2A há muito tempo, e já era notável como elas funcionavam”, diz o Dr. Lowe, que também é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. “Este estudo diz que há muito mais do que isso, com importantes implicações terapêuticas”.

A perda adicional dos interferons cria um golpe duplo que torna os tumores invisíveis para os defensores no sistema imunológico e ajuda o câncer a se espalhar, descobriram os pesquisadores.

“Tem sido difícil estudar esses interferons porque eles são codificados por um conjunto de 16 genes”, acrescenta Dr. Lowe. “O uso do MACHETE revelou uma maneira importante pela qual as células cancerígenas em desenvolvimento evitam ser reconhecidas pelo sistema imunológico e que também pode levar à resistência a imunoterapias destinadas a reativar o sistema imunológico para atacar o câncer”.

A coautora Dana Pe’er, bióloga computacional do Sloan Kettering Institute, foi fundamental para ajudar a equipe a entender como a interrupção dos genes do interferon afetou células imunes e ajudou o câncer a escapar do sistema imunológico, diz o Dr. Lowe.

Além do câncer pancreático, as descobertas foram verdadeiras para um modelo de melanoma em camundongo.

A pesquisa sugere, então, que os pacientes cuja região do interferon ainda está intacta podem ser melhores candidatos à imunoterapia do que aqueles que a perderam. As imunoterapias podem fazer maravilhas, mas um dos grandes desafios tem sido identificar quais cânceres de pacientes responderão a elas e quais não responderão.

Mesmo testes genômicos de ponta, como o MSK-IMPACT, no entanto, normalmente não coletam informações sobre esse grupo de genes de interferon. Estudos adicionais podem mostrar se adicioná-lo aos testes de sequenciamento pode ajudar a identificar pacientes com maior probabilidade de se beneficiarem Imunoterapiaobserva o Dr. Lowe.

Enquanto isso, as deleções do CNA têm sido associadas a uma variedade de distúrbios genéticos humanos chamados síndromes de deleção cromossômica. “Assim, o MACHETE fornece uma nova estrutura para investigar grandes eventos de exclusão além de apenas Câncer“, diz o Dr. Barriga, observando que meia dúzia de outros grupos de pesquisa já estão usando a técnica desenvolvida pelo Instituto Sloan Kettering.