As telas do ‘CAR pooling’ identificam as células de imunoterapia contra o câncer mais eficazes

Geração e triagem de uma biblioteca agrupada de CARs com diversos domínios de sinalização. (A) Nossos CARs combinam um αCD19 ScFv (FMC63), uma dobradiça CD8 e um domínio transmembranar (TMD), um domínio de sinalização intracelular e um domínio CD3ζ (esquerda). Quarenta domínios de todo o proteoma humano foram otimizados por códons, sintetizados, agrupados em uma biblioteca de plasmídeos e empacotados para gerar lentivírus (à direita). Estas famílias de proteínas abrangem tais como a superfamília de imunoglobulinas (IgSF); célula T/transmembrana, imunoglobulina e mucina (TIM); superfamília de receptores de TNF (TNFRSF); e desencadeando receptores expressos em células mieloides (TREM). (B) Diagrama de Venn mostrando a expressão natural dos membros da biblioteca em todos os tipos de células imunes. Os padrões de expressão estão listados na tabela S1. NKT, célula T natural killer; DC, célula dendrítica. (C) Células T CD4 e CD8 humanas primárias foram isoladas separadamente de PBMCs para dois doadores humanos e transduzidas lentiviralmente com a biblioteca. As células foram purificadas por FACS usando fluorescência T2A-GFP dentro de um log da expressão média para reduzir a variabilidade. (D) A biblioteca agrupada foi estimulada repetidamente 1:1 com CD19⁺ ou CD19⁻ células tumorais K562 irradiadas para quantificar a ativação específica do antígeno (CD69), produção de citocinas (IFN-γ e IL-2) e proliferação [CellTrace Violet (CTV)]. A biblioteca também foi sequenciada nos pontos de tempo especificados para medir a expansão relativa de construções individuais. (E) Porcentagem de CD8⁺ Células T expressando diferentes números de marcadores de exaustão (PD1, TIM3, LAG3 e CD39) após um ensaio de estimulação repetida com CD19⁺ células tumorais K562 irradiadas. As células T que expressam CARs somente CD28, 4-1BB ou CD3ζ são comparadas a células não transduzidas (Untrans.). As caixas cinzentas correspondem a pontos de tempo em que não permaneceram células vivas. A significância foi avaliada em células T CD8 para dois doadores usando um modelo ANOVA de medidas repetidas. *P = menor que 0,05 e ***P = menor que 0,001 corrigido para FDR; ns, não significativo. O segundo doador e dados para CD4⁺ As células T são mostradas na fig. S1 (A e B). (F) Usamos o FlowSeq, um fluxo de trabalho de quantificação agrupado baseado em sequenciamento FACS e de próxima geração, para quantificar o enriquecimento classificando a biblioteca em caixas de sinal fluorescente correspondentes a uma leitura funcional, conforme mostrado pelos histogramas coloridos. Em seguida, amplificamos o domínio coestimulatório por extração de DNA genômico e PCR e realizamos o sequenciamento de amplicon em cada bin para estimar o fenótipo para cada membro da biblioteca. Crédito: Medicina Translacional da Ciência (2022). DOI: 10.1126/scitranslmed.abm1463

Nos últimos anos, células imunes geneticamente modificadas – armadas com armas moleculares para reconhecer e destruir células tumorais – mudaram o cenário do tratamento do câncer. Agora, pesquisadores da UC San Francisco desenvolveram um novo método para comparar um grande número dessas células CAR-T, cada uma com características moleculares ligeiramente diferentes, para determinar qual é mais eficaz e duradoura contra o câncer.

Em seu estudo publicado em 9 de novembro de 2022, em Medicina Translacional da Ciênciaa equipe usou a abordagem – apelidada de “CAR Pooling” – para estudar células CAR-T com quarenta receptores. A tela, que pode ser expandida para testar centenas ou milhares de combinações de receptores no futuro, já revelou novos e surpreendentes receptores que tornam essas células terapêuticas mais poderosas.

“As células CAR-T têm sido absolutamente transformadoras para muitas pessoas com câncer no sangue”, disse o autor sênior Kole Roybal, Ph.D., professor associado de microbiologia e imunologia da UC San Francisco e membro do Instituto Gladstone-UCSF de Genômica Imunologia. “Este trabalho é um trampolim para a engenharia dessas células de maneiras ainda mais inteligentes, para que funcionem melhor, por mais tempo e em mais tipos de câncer”.

Um tratamento transformador

As células T são um tipo de glóbulos brancos que expressam receptores em sua superfície que reconhecem materiais estranhos no corpo. Quando uma molécula ou partícula correspondente se encaixa no receptor da célula T, a célula lança um resposta imune para afastar o invasor. Esse tipo de resposta pode destruir não apenas vírus e bactérias, mas células cancerosas também.

Quando um paciente com câncer está sendo tratado com terapia com células CAR-T, os médicos coletam células T do sangue do paciente ou de um doador saudável. Em seguida, eles alteram essas células no laboratório, adicionando DNA que estimula o células imunes na produção de receptores de antígenos quiméricos (CARs) especiais que reconhecem o câncer em sua superfície. As células modificadas são cultivadas e injetadas de volta no paciente. Os novos CARs ajudam as células T a atacar especificamente as células cancerígenas. Uma variedade de células CAR-T foi aprovada para uso em cânceres do sangue, incluindo linfomas, leucemias e mieloma múltiplo.

“Nossa capacidade de retirar as células T do corpo, adicionar novos programas genéticos a elas e colocá-las de volta no corpo como uma terapia programável viva já teve um enorme impacto no tratamento de cânceres hematológicos”, disse Daniel Goodman, Ph. .D., bolsista de pós-doutorado da UCSF e co-primeiro autor do novo estudo. “No entanto, este é apenas o começo do que as células projetadas podem ser capazes se entendermos mais completamente como manipular sua sinalização e propriedades funcionais”.

Os pesquisadores têm lutado para fazer com que as células CAR-T funcionem contra tumores sólidos. Mesmo para muitos pacientes com câncer no sangue, as células CAR-T funcionam apenas temporariamente ou não funcionam.

Um dos fatores limitantes no desenvolvimento de novas terapias com células CAR-T é a tecnologia de alto rendimento necessária para modificar e testar novos receptores; em todo o sistema imunológico existem centenas de peças receptoras que podem se encaixar como peças de Lego em milhares de combinações possíveis.

Simplificando os testes de células T

Roybal, Goodman e a co-primeira autora Camillia Azimi desenvolveram o CAR Pooling para testar rapidamente a eficácia de diferentes CARs de uma só vez. A tela funciona gerando uma biblioteca de DNA contendo os códigos genéticos para muitos receptores imunológicos, introduzindo-os simultaneamente em milhões de células e, em seguida, fazendo com que as células compitam – em tubos de ensaio – por suas habilidades de sobrevivência, crescimento, reconhecimento e destruição do câncer.

“Nosso método torna o processo de teste de novas terapias baseadas em receptores muito mais rápido”, diz Azimi, um estudante de pós-graduação da UCSF na época. “Isso não apenas permite que os pesquisadores economizem tempo, mas também explorem projetos que não seriam capazes de testar individualmente”.

Entre os 40 CARs testados no novo estudo, por exemplo, não estavam apenas os receptores clássicos de células T, mas também receptores emprestados de outros tipos de células imunes relacionadas. Por exemplo, um receptor de células B chamado BAFF-R é o principal concorrente para tornar uma célula T particularmente eficaz contra o câncer.

“Nós nunca teríamos escolhido testar o BAFF-R se não estivéssemos utilizando o CAR Pooling”, diz Azimi.

Quando a célula CAR-T contendo BAFF-R foi testada em camundongos com mieloma múltiplo, os camundongos sobreviveram por mais tempo e tiveram menos câncer em comparação com camundongos que receberam células CAR-T padrão.

Uma plataforma para estudos futuros

A equipe de pesquisa está planejando expandir o uso do CAR Pooling para testar ainda mais receptores em células T reprojetadas. Eventualmente, disse Roybal, a abordagem poderia ser usada para desenvolver diferentes variedades de células CAR-T para diferentes tipos de câncer; provavelmente não há uma resposta única quando se trata de diversos tipos de câncer.

“Certamente poderíamos usar o CAR Pooling para encontrar rapidamente os melhores receptores para configurações clínicas específicas”, diz ele. “Um conjunto de receptores pode ser mais benéfico para o glioblastoma, mas outro mais benéfico para o mieloma”.

À medida que os pesquisadores examinam cada vez mais receptores imunológicos, eles esperam revelar padrões subjacentes em como os receptores ditam a atividade das células imunológicas. Eventualmente, isso pode levar a ainda mais receptores sintéticos que podem assumir não apenas Câncermas outras doenças.

“Esperamos aprender a compor as peças fundamentais desses domínios de sinalização e construir a próxima geração de terapias celulares projetadas”, diz Goodman.

O laboratório também está trabalhando para entender e melhorar outros aspectos das células CAR-T, além de seus receptores, para aumentar a eficácia da terapia.

“Há muitas maneiras de modificar essas células”, diz Roybal. “Esta é apenas uma peça do quebra-cabeça.”