TBX20 melhora a reprogramação de fibroblastos cardíacos em células musculares cardíacas

A superexpressão de TBX20 leva à melhora funcional dos hiCMs. A, Quantificação de cardiomiócitos induzidos por humanos batendo observados (hiCMs) derivados de fibroblastos derivados de H9 (H9Fs) após 1 mês de co-cultura com cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC-CMs; n = 10 para cada grupo, repetido 2 vezes independentemente). B, Rastreamento e medições de imagens de microscopia mostram transientes de cálcio em células co-cultivadas MGT + vetor vazio (EV) ou MGT + TBX20, conforme indicado em A. C, Quantificação do pico medido ΔF/F0 em hiCMs co-cultivados (n = 33 , repetido 2 vezes independentemente). D, Imagens de fluorescência de campo claro e GFP (proteína fluorescente verde) mostrando hiCMs individuais induzidas por MGT+TBX20 após co-cultura. O painel direito mostra os traços ópticos selecionados do potencial de membrana (Vm) durante o batimento espontâneo com uma duração de ciclo de 270 ms. E, Análise de enriquecimento de conjunto de genes de dados de sequenciamento de RNA de hiCMs derivados de H9F mostrando as marcas registradas enriquecidas em genes regulados para cima e para baixo de TBX20. F, Imagens representativas e quantificação do conteúdo de mitocôndrias marcadas usando MitoTracker em troponina cardíaca T (cTnT) + hiCMs derivadas de H9F (n = 20 por grupo). Barras de escala, 10 μm. G, Resultados da reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa mostrando a razão relativa do DNA mitocondrial para o DNA genômico total em hiCMs derivados de H9F (n = 6 por grupo). H, Perfil de taxa de consumo de oxigênio representativo analisado a partir do ensaio de mito-estresse Seahorse em hiCMs derivados de H9Fs (n = 10 por grupo, repetido 3 vezes independentemente). I, Quantificação da respiração basal, respiração máxima, vazamento de prótons, capacidade respiratória de reposição, produção de adenosina trifosfato (ATP) e capacidade respiratória de reposição como porcentagem em hiCMs tratados com MGT+TBX20 ou MGT+EV de H9Fs (n=10 por grupo ). J, Perfil de taxa de acidificação extracelular representativo analisado a partir do ensaio Seahorse de estresse de glicose em hiCMs tratados com TBX20 ou tratados com EV derivados de H9Fs (n = 10 por grupo). K, Quantificação da glicólise, capacidade glicolítica e reserva glicolítica em hiCMs derivados de H9F transduzidos com TBX20 ou EV (n = 10 por grupo). Todos os dados são expressos como média ± SEM (A, C, F, G, I e K, teste t de Student). *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001. ECAR indica a taxa de acidificação extracelular; FDR, taxa de falsa descoberta; e OCR, taxa de consumo de oxigênio. Crédito: Circulação (2022). DOI: 10.1161/CIRCULAÇÃOAHA.122.059713

Os corações dos mamíferos quase não têm capacidade de desenvolver novas células do músculo cardíaco, chamadas cardiomiócitos, após o nascimento. Assim, o tecido morto após um ataque cardíaco adulto não é reparado com novos cardiomiócitos. Em vez disso, é substituído por tecido cicatricial que enfraquece o poder de bombeamento do coração e muitas vezes leva à insuficiência cardíaca.

Uma estratégia promissora para remuscularizar o coração lesado é a reprogramação cardíaca direta de células de fibroblastos do coração em cardiomiócitos. Em um artigo publicado em CirculaçãoUniversity of Alabama em Birmingham pesquisadores Yang Zhou, Ph.D., e Rui Lu, Ph.D., identificaram TBX20 como o fator de transcrição ausente chave em coquetéis existentes para reprogramação cardíaca direta de fibroblastos humanos.

Adicionando TBX20 ao coquetel de reprogramação MGT 133, eles relatam, promoveu a reprogramação cardíaca e ativou genes associados à contratilidade cardíaca, maturação e localização ventricular da célula do músculo cardíaco. Mecanicamente, eles descobriram que o TBX20 se coloca sinergicamente com os fatores de reprogramação MGT em potenciadores de genes cardíacos, causando ativação robusta de genes-alvo.

“Nosso estudo destaca o papel não documentado do TBX20 como um regulador vital da reprogramação cardíaca humana direta”, disse Zhou. “Aprimorar a eficiência e a qualidade da reprogramação cardíaca direta de fibroblastos humanos é um passo crítico na tradução clínica dessa tecnologia”.

Uma área importante para investigação futura, diz Zhou, será testar o TBX20 in vivo para reprogramação direta.

Os coquetéis atuais para reprogramação direta de fibroblastos humanos sofrem de baixa eficiência e produção insuficiente de cardiomiócitos funcionais. Os pesquisadores da UAB identificaram o TBX20 como o fator mais subexpresso quando compararam cardiomiócitos induzidos a partir de fibroblastos com um coquetel atual versus cardiomiócitos funcionais.

A adição de TBX20 promoveu a reprogramação cardíaca, como visto na ativação de genes cardíacos relacionados à estrutura do sarcômero, canais iônicos e contrações cardíacas. O sarcômero é a menor unidade funcional do músculo estriado.

Os fibroblastos do coração humano do ventrículo serão o alvo primário para avaliação da reprogramação in vivo. Zhou e colegas mostraram que o TBX20 foi essencial na reprogramação desses fibroblastos para cardiomiócitos induzidos, sugerindo um potencial terapêutico para o TBX20.

Em detalhe, o TBX20 ativou principalmente os genes no estágio final da reprogramação, aumentando o fluxo de cálcio, a contratilidade e a função mitocondrial nos cardiomiócitos induzidos. As mitocôndrias são a fonte de energia para coração contrações musculares. O TBX20 pareceu ajudar as mitocôndrias nos cardiomiócitos induzidos a mudar para uma respiração semelhante ao cardiomiócito adulto.

Mecanicamente, os pesquisadores da UAB descobriram que o TBX20 estava ligado e ativou os potenciadores de genes cardíacos. Um potenciador é um elemento regulador curto no DNA que pode se ligar a proteínas ativadoras para iniciar a transcrição ou aumentar a transcrição de um determinado gene alvo. A transcrição é a produção de RNA mensageiro copiado do gene de DNA para codificar uma proteína. Os intensificadores geralmente funcionam à distância de seu alvo gênico.

Essa ligação do TBX20, descobriram Zhou e colegas, exigia todos os três fatores do coquetel MGT para ajudar a ativar os genes cardíacos. TBX20 sozinho não foi suficiente para induzir a conversão do destino das células cardíacas; a omissão de qualquer um dos três fatores MGT reduziu substancialmente a eficiência da reprogramação.

“Juntos, nossos achados demonstram que o TBX20 requer fatores MGT intactos para promover a reprogramação direta e ativar a função cardíaca. genese eles apoiam a noção de que a reprogramação cardíaca direta é um processo sinergicamente regulado orquestrado por vários fatores”, disse Zhou.

O perfil de sequenciamento de RNA de célula única identificou dois grandes grupos de células após reprogramando com TBX20. Um foi reprogramado com cardiomiócitos induzidos, mas o outro grupo foi apenas parcialmente reprogramado. O cluster de cardiomiócitos reprogramados apresentou perfis de expressão gênica semelhantes aos cardiomiócitos ventriculares.